通常使用兩種方式來製備勝任細胞:氯化鈣法及電穿孔法 氯化鈣法:利用氯化鈣來使細胞膜 ... in calcium chloride (CaCl2) to make the cell membrane more permeable. ... <看更多>
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勝任細胞cacl2 在 Preparation of Competent Cells Using Calcium Chloride 的推薦與評價
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勝任細胞cacl2 在 國立屏東教育大學化學生物系研究所Graduate Institute of ... 的推薦與評價
勝任細胞 的製作. ... CaCl2‧2H2O,250 mM KCl,55 mM MnCl2‧4H2O)使菌體懸浮,再將培養液放置冰 ... 的DNA 到含勝任細胞(competent cell)的管中後就放到液態氮中冷凍。 ... <看更多>
勝任細胞cacl2 在 Role of calcium chloride during competent cell preparation 的推薦與評價
Although we do not have any conclusive proof about how CaCl2 works, the suggested mechanism is much similar to what you have suggested. ... <看更多>
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※ 引述《bolly (bolly)》之銘言:
: 我們實驗室之前都是直接買kit作transform
: 但是我覺得有點浪費 所以想試著自己作作看
: 我用一瓶看起來有點年代的氯化鈣配製成0.1M溶液(已滅菌)
: 將0.5ml over-night菌液加入50ml LB養到OD 0.4
: 3200g離心去除上清液 加入20ml氯化鈣使懸浮
: 置冰上40min 離心10min 去除上清液
: 最後加1ml氯化鈣重新懸浮 分裝0.2ml一管
: 製作的菌種是DH5aphla 和BL21(DE3)
: 直接作transform 但是都長不出來
: 我想請問製作過程還需要注意什麼小細節
: 因為我是自己摸索 已經作過好幾次都不成功
: 之前有請別間實驗室的學姐教過 有作出來
: 但是使用的藥品是他們實驗室配的
: 回來自己作的幾次都失敗 很灰心= =
前置
1. CaCl2
60mM CaCl2----2.088g
15% Glycerol-30mL
10mM PIPES----0.6048g
-----------------------
add ddw to 200mL
2.加熱溶解後冷卻
3.滴定pH到 7.0
4.滅菌後冷卻放到4C保存
製作==要訣就保持低溫 跟輕輕沖洗
1.50mL LB+10uL origenal E.coli
2.Incubate at 37C for 16hr (DH5A)
3.Transfer 4mL Step2 to 400 LB medium
5.測定到OD590-0.375 到達後分裝到50cc tube, incubate on ice for 10min.
6.離心10min 3000rpm.4C
7.移除LB 加入CaCl2 10mL 懸浮(on ice)<--清清沖洗
8.離心5min. 2500rpm. 4C
9.移除CaCl2.加入CaCl2 10mL, incubate on ice for 10min
10.離心5min. 2500rpm. 4C
11.移除CaCl2,加入2mL重新懸浮後放置冰中overnight(冰桶丟4C冰箱)
12.離心5min. 2500rpm. 4C
13.移除CaCl2,加入新的2mL後分裝到eppendorf 保存-80C
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◆ From: 163.15.174.206
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