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superred pcr 在 [求救]PCR一直跑不出來- 看板Biotech - 批踢踢實業坊 的推薦與評價
大家好,實驗室同伴跑PCR一直跑不出來,這實驗曾經一度有做出來過,只是後來不知怎
麼地就一直失敗,持續失敗了半年,也爬過很多文,就是找不出方法。實驗室的學長、助
理(我)都跳進來幫忙做過,因為大家都是這方面的新手,所以一開始一直以為是操作問題
,所以用相同的條件重複了n次,primer、polymerase也都重買過,還是出不來。後來因
為有了positive control,positive control 都有跑出來,但想要的 gene 就是跑不出
來,而且都有拖帶,希望大家能給一點改善的意見,謝謝!
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我們有 blast 確定設計的 primer 專一性沒問題,也可以夾出要的 gene。
F primer 的長度是36, GC%=44 Tm=64.4
R primer 的長度是37, GC%=54 Tm=68.9
gene大小是 2.8 kb
postive control是 2 kb
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下面是幾張在有postive control後,跑膠的結果
一開始用的是下面的條件:
PCR program:
1. 95’c, 30sec
45~55’c, 30sec
72’c, 2mins (35 cycles)
2. 72’c, 8mins
3. 16’c, hold
genomic DNA template : 50 ng
dNTP:500 μM
F&R primer:0.5 μM
10x buffer:2 μL
sterile DI water:13 μL
Pro Taq Plus DNA Polymerase:2 units
*total reaction: 20 μL
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爬了一些關於有拖帶的文章,看到了幾個可能原因:
1.template濃度太高
2.dNTP濃度太高
3.primer濃度太高
4.cycle數太多
5.annealing溫度太低
以及有些版友推薦在 reaction 加 1~5% 的 DMSO
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所以做了一些改變
PCR program:
1. 95’c, 30sec
2. 95’c, 30sec
50~65’c, 30sec
72’c, 2mins 30sec (30 cycles)
3. 72’c, 8mins
4. 10’c, hold
genomic DNA template : 50 ng
dNTP:200 μM
F&R primer:0.2 μM
10x buffer:5 μL
sterile DI water:40 μL
Pro Taq Plus DNA Polymerase:2 units
*total reaction: 50 μL
結果還是一樣拖帶....Orz
想請問大家還有其他改善方法嗎?
是應該在增加DMSO濃度?還是說還是太多cycle嗎?
版上有看到有些人建議加 Betaine,但因為看到這種解決多是增對 GC rich 的片段,加
上我們實驗室沒有,請問有需要添購嗎?
拜託大家幫幫忙了!!!!非常感謝
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.120.93.70
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1467621799.A.2F7.html
稀釋成 5ng/50μL 結果連postive control 都沒出來了囧
※ 編輯: pongpongding (111.83.149.104), 07/04/2016 18:17:50
結果今天試了,都沒成功,10%的在<200bp的地方竟然還出現一條band,不知為何><
是之後要做突變的
較好嗎?
※ 編輯: pongpongding (114.38.149.138), 07/05/2016 07:49:58
quality比較好的gDNA先確定實驗p不出來是不是primer的問題
※ 編輯: pongpongding (140.120.93.70), 07/05/2016 10:23:01
※ 編輯: pongpongding (140.120.93.70), 07/05/2016 14:48:46
※ 編輯: pongpongding (140.120.93.70), 07/05/2016 15:01:10
看~
※ 編輯: pongpongding (111.83.204.77), 07/09/2016 06:49:07
※ 編輯: pongpongding (111.83.204.77), 07/09/2016 06:49:32
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