ubiquitination原理 在 コバにゃんチャンネル Youtube 的最佳解答
「ubiquitination原理」的推薦目錄：
- 關於ubiquitination原理 在 コバにゃんチャンネル Youtube 的最佳解答
- 關於ubiquitination原理 在 大象中醫 Youtube 的精選貼文
- 關於ubiquitination原理 在 大象中醫 Youtube 的最讚貼文
- 關於ubiquitination原理 在 Re: [求救] IP的方法測Protein的ubiquitination - 看板Biotech 的評價
- 關於ubiquitination原理 在 Ubiquitination of Proteins and Protein Degradation - YouTube 的評價
- 關於ubiquitination原理 在 ubiquitination原理2023-精選在Youtube/網路影片/Dcard上的 ... 的評價
- 關於ubiquitination原理 在 ubiquitination原理2023-精選在Youtube/網路影片/Dcard上的 ... 的評價
ubiquitination原理 在 Ubiquitination of Proteins and Protein Degradation - YouTube 的推薦與評價
Ubiquitination is an enzymatic post-translational modification in which a ubiquitin protein is attached to a substrate protein. ... <看更多>
ubiquitination原理 在 ubiquitination原理2023-精選在Youtube/網路影片/Dcard上的 ... 的推薦與評價
ubiquitination原理 2023-精選在Youtube/網路影片/Dcard上的焦點新聞和熱門話題資訊，找ubiquitination原理在Youtube上2023年該注意什麼？ ... <看更多>
ubiquitination原理 在 Re: [求救] IP的方法測Protein的ubiquitination - 看板Biotech 的推薦與評價
補充一些可以考慮的點
※ 引述《shinchenboy (欣承男孩)》之銘言：
: 各位版友大大前輩們好
: 小弟最近實驗想探討在乳癌細胞中某non-coding RNA對於其
: Target protein ubiqutination的影響
: 看paper幾乎都是以IP的方式來做
: 原理大致上是把Target protein用抗體抓下來後
: 然後在western上用Ub的antibody來做hybridization
同前一篇 patricksky 大及其他人所言
你有用過這抗體先測試做 IP 或 WB 嗎?
理想狀態下
你應該要有兩隻對你的目標蛋白質具專一性且能用在 IP 與 WB 的抗體
然後拿一隻來做 IP 另一隻做 WB
: 所以小弟我的實驗設計也是仿照paper的模式
: 在MCF-7細胞建立Over-expression ncRNA及Control的Model後
: 隔天在收細胞前先以MG132(20uM)處理4h(也是參考paper的條件)
MG132 的使用需小心
首先 MG132加到培養基中會立刻結晶沉澱
要注意搖勻的問題
其次你有沒有做濃度與時間曲線
找出最適合你實驗的處理條件
最後
對某些蛋白質而言
加入 MG132反而會改變其表現
: 然後把細胞收下來後開始進行IP的實驗
: 我的實驗流程如下
: 1.先以RIPA buffer(sigma)冰上反應30min(每5min vortex 10s)，然後離心後取
: 上清液
你有沒有加入 de-ubiquitinylating inhibitors?
例如 NEM, IAA, PR619等
沒加的話
Ub 會在實驗過程中喪失
你預期的 band 會消失
: 2.Protein定完量後，固定為800ug protein為一個IP，總體積200ul，並留80ug protein
: 作為Input(先煮好，保存於-80)
: 3.先讓Protein和G bead反應約6h，把會和G bead結合的protein分離出來
: 4.把剩下沒和G bead結合的protein加入抗體(1:100)，4度C反應Overnight
: 5.隔天把G bead加進去，也是4度C反應Overnight
抗體與 beads 間有沒有做 cross-linking?
特別是你的蛋白質與泛素化後的蛋白質分子量是在一個尷尬的位置
IP 後如果抗體跟著蛋白質一起被洗出
WB 時你就會看到抗體的 band 了
: 6.隔天用磁座把G bead-Ab-protein complex分離出來，用wash buffer洗三次5min
你的 wash buffer 是什麼?
夠不夠 harsh?
這裡需要一個夠 harsh 的 wash buffer
把所有非專一結合的雜質蛋白質全洗出去
只留下你與抗體穩定結合的目標蛋白質
但要這樣做前提是你務必要做 cross-linking
: 7.加入sample buffer後煮10min
: 8.Western blot
: 然後現在結果出來了不太理想，有幾個問題
: 1.看paper Ub-protein沒有只是單一條band而已，譬如我的target protein分子量在43kD
~~~~~~~~~
這在說什麼?
: ，理論上來說它在接上Ub後band會出現在43kD的上方連續好幾條band，但是我的結果似乎
: pattern沒有和paper那麼像，只有兩條band，位置出現在50kD和70kD附近
: 2.我的Negative control抓到很多很奇怪的雜band，而且有兩條也在我預計想看的
: protein相同位置上
同 patricksky 所問, Negative control 是什麼?
你有沒有同時跑兩片 WB?
一片用你手上有專一性, 可辨認目標蛋白質的抗體跑
另一片用可辨認 Ub 的抗體如 FK1, FK2, P4D1 染
再來交叉比對 band 的位置
就可以推論出哪些 band 是有 Ub 的 band
: 跟老師和學長姐討論之後，認為那些band都不是我要看的，簡單來說就是有可能我的
: Ab沒有成功把target protein抓下來
: 目前我想到的解決方式有幾個
: 1.先用WB測試我的target protein 有沒有被Ab抓下來
基本一定要做的
: 2.提高IP反應Protein的量
不預期會有效果
: 3.外送Ub plasmid
: 想請問各位大大們還有甚麼其他意見嗎??? 感激不盡~
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 162.129.251.85
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1449244433.A.B72.html
... <看更多>