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海藻糖的知識加 #文章非常長 #資料很齊全
資料來源:A+醫學百科
http://goo.gl/xXoizt
海藻糖(Trehalose)是一種安全、可靠的天然糖類,1832年由Wiggers將其從黑麥的麥角菌中首次提取出來,隨後的研究發現海藻糖在自然界中許多可食用動植物及微生物體內都廣泛存在,如人們日常生活中食用的蘑菇類、海藻類、豆類、蝦、麵包、啤酒及酵母發酵食品中都有含量較高的海藻糖。
海藻糖是由兩個葡萄糖分子以α,α,1,1-糖苷鍵構成的非還原性糖,自身性質非常穩定,並對多種生物活性物質具有神奇的保護作用。科學家們發現,沙漠植物卷葉柏在乾旱時幾近枯死,遇水後卻又可以奇蹟般復活;高山植物復活草能夠耐過冰雪嚴寒;一些昆蟲在高寒、高溫和乾燥失水等條件下不凍結、不幹死,就是它們體內的海藻糖創造的生命奇蹟。海藻糖因此在科學界素有「生命之糖」的美譽。國際權威的《自然》雜誌曾在2000年7月發表了對海藻糖進行評價的專文,文中指出:「對許多生命體而言,海藻糖的有與無,意味著生命或者死亡」。
海藻糖對生物體具有神奇的保護作用,是因為海藻糖在高溫、高寒、高滲透壓及乾燥失水等惡劣環境條件下在細胞表面能形成獨特的保護膜,有效地保護蛋白質分子不變性失活,從而維持生命體的生命過程和生物特徵。許多對外界惡劣環境表現出非凡抗逆耐受力的物種,都與它們體內存在大量的海藻糖有直接的關係。而自然界中如蔗糖、葡萄糖等其它糖類,均不具備這一功能。這一獨特的功能特性,使得海藻糖除了可以作為蛋白質藥物、酶、疫苗和其他生物製品的優良活性保護劑以外,還是保持細胞活性、保濕類化妝品的重要成分,更可作為防止食品劣化、保持食品新鮮風味、提升食品品質的獨特食品配料,大大拓展了海藻糖作為天然食用甜味糖的功能。
海藻糖是運用當代最先進的生物工程技術和生產工藝,採用按國際製藥標準建造的成套設備,以當地特有的不含轉基因成分的天然木薯澱粉為原料,在國內首家以規模化形式生產海藻糖,產品指標達到國際同類產品標準。先進的生產工藝技術和完整的質量保證體系為國內外市場提供了質量過硬、價格合理的海藻糖系列產品,使生物製劑、化妝品、烘焙產品、水產畜產加工、米面製品、飲料和糖果以及農林種植等各個行業廣泛受惠。
應用
1.海藻糖在食品工業中的應用:
與其它糖類一樣,海藻糖可廣泛應用於食品業,包括飲料、巧克力及糖果、烘烤製品和速凍食品。
●烘烤製品類
在烘烤製品中,海藻糖有多種潛在的使用價值:它能調節蛋糕、餅乾和糕點上的糖霜、麵包奶油和水果餡的甜味與芳香,不損害貯藏壽命,使人們品嘗到產品原有的風味。
同時,海藻糖有助於甜餅、麵包奶油和糖霜中脂肪的降低,在可口餅及快餐中產生獨特的糖霜感覺。它使消費者因良好的甜質更容易接受含高脂肪和糖的高熱量產品。在保持產品貯藏期時,海藻糖能減少多成 分的烘烤製品中濕氣流動,以能使甜味更佳。
●糖果類
海藻糖與其它大多數增甜劑混合,可在糖果、果汁飲料和藥草產品中使用,以調節產品甜質,從而能真正保持產品的原有風味。
海藻糖用作糖果的外層可形成一種穩定的非吸濕性保護層。由於 性質的穩定性,海藻糖能在長期高溫下進行而不用擔心水解和色變,不負面影響產品品質。
滾海藻糖衣性能極好。海藻糖特有的溶解特性能真正使它們本身滾動形成保護層,這層覆蓋物極穩定、堅固,從而改善其它大多數增甜劑相對的白色層面。
●能量產品類
海藻糖被分解成葡萄糖,但與其他糖相比,海藻糖的血糖反應更平穩,這種獨有的特性結合它低致齲性和非瀉下性作用,使得海藻糖極適用於按配方製造的飲料,以提供能量和減輕疲勞與壓力。
●功克力糖果類
在巧克力糖果中使用海藻糖,能調節糖果的甜味,特別有益於含有乳製品的軟糖及含水果餡的產品,海藻糖還能減少多成分產品中水分游離。在模製品中,海藻糖對產品甜味的改善為創造新 口味巧克力提供了可能性。
由於它致齲性的降低,作為主要的增甜劑或結合其他低致齲性增甜劑,海藻糖可用於按配方配製益牙產品。特級海藻糖可和多元醇合用於製取巧克力,其溶解時 吸收的熱量可使多元醇的冷卻效應降到最低。
●水果類
在經加工過的水果(包括果醬、調味果醬和果餡)中,海藻糖是一種最好的甜味調節劑。在水果類製品中添加海藻糖能夠保持產品的原有風味 但不損害產品貯藏期。
另外,由於海藻糖性質的穩定性,不會產生水解,產品色澤不變並保持原有光澤。
海藻糖能用於佐料和可口果醬,通過調節甜味來產生風味感,同時保持產品貯藏壽命。
●速凍品類
海藻糖可代替蔗糖,降低冰淇淋和其他冷凍製品的凝結點。可在凍品和冰凍糖果中用於產生新的糖霜,併產生獨特的可口的風味。
●飲 料
海藻糖在飲料品中微甜口感好,能與其他大多數增甜劑結合使用,使其甜味更完善,可全面提高產品風味。在含酒精的飲料中,海藻糖不損減酒精的感官性能, 使飲料風味更佳。
●海鮮
海藻糖作為一種對海鮮的低溫保護劑特別有效,當海藻糖在蛋白質、水界面絕對抑制水的官能度時使海鮮的硬度、伸縮性及凝膠力增加,另外海藻糖的微甜 性質也提高了海鮮的口感質量。與其他的低溫保護劑用於處理海鮮不同,海藻糖不會導致喉嚨熾熱感,且沒有瀉下問題。
2.海藻糖在醫藥工業中的應用:
(1)在醫學上已經成功地應用海藻糖替代血漿蛋白作為血液製品、疫苗、淋巴細胞、細胞組織等生物活性物質的穩定劑。不僅可以常溫條件下乾燥存放,更重要的是可以防止因血源污染而引起B肝、愛滋病等致命疾病的傳播,世界衛生組織對此十分重視。
(2)英國劍橋的Quadrant研究基金會將小兒麻痹症疫苗與海藻糖混合凍干後,發現在乾燥狀態下45℃時其穩定性和液態4℃保存條件時相當。這項目研究成功,將大大減化疫苗處理工序,降低疫苗的貯存及運輸成本,且保證了長距離運輸疫苗仍可保持相當高的活性,這將會大大有助於世界衛生組織實現在最大範圍內消滅小兒麻痹症的目標。
(3)美國加利福尼亞大學的約翰•克勞及其同事將海藻糖與製造血小板的細胞混合,經乾燥脫水使細胞變干後,將其凍干在室溫下可長時間保存。實踐證明,加入海藻糖並經長時間保存的血小板在水化後仍有85%存活,存活率比大多數血庫短期保存的血小板還高。
(4)海藻糖可應用於研究用生物試劑的保存,例如各種工具酶、細胞膜、細胞器、抗體、抗原及病毒等等,使得生命科學研究更為方便快捷有效,英國大學Camilo.C等詳細的研究了海藻糖對DNA限制性內切酶DNA連接酶和DNA聚合酶的保護作用,結果表明,所有加入海藻糖乾燥的酶樣,在70℃保存35天或在37℃保存9個月後,其活力並無損失,仍能精確的將DNA截斷。我國中科院微生物研究所應用海藻糖乾燥製備、用於人血清膽固醇測定的三種診斷工具酶,在室溫下長期保存後,活性保持率都在90%以上,現已成功的進入於臨床應用。這是目前其它種類的保護劑都不可能達到的效果,利用海藻糖作為診斷工具酶等生物試劑的穩定劑和保護劑,可置於常溫條件下乾燥並保存,不僅簡化了生物試劑的製備過程,也給我國幅員廣大的農村地區患者的疾病診治帶來便利。
(5)雙岐桿菌是腸道中用於改善人體微生態平衡的細菌,雙岐桿菌活菌製劑作為防病治病的有力武器,在歐美日本等已開發國家倍受歡迎。在我國,雙岐桿菌活菌製劑已逐步成為製藥行業的一支生力軍。由於雙岐桿菌是一種對生存條件要求極為苛刻的厭氧菌,外界環境稍有變化就易引起該菌的死亡,因此,如何提高雙岐桿菌的存活率,保證產品的貨架壽命,一直是困擾活菌製劑行業的技術難題。目前普遍是採用脫脂牛奶作凍干保護劑,但效果不甚理想,在儲存過程中,細菌的存活率下降很快。近期的研究結果表明,採用海藻糖作保護劑,雙岐桿菌的存活率比脫脂牛奶提高一倍以上,特別令人振奮的是,海藻糖能夠使凍干雙岐桿菌在常溫下長期保持活性,大幅度延長活菌製劑的保質期。從而可以解決活菌製劑行業所面臨的產品儲存性能差,貨架壽命短的問題。
(6) 應用實例
1)、從液態製品製備固態製品
將500克無水海藻糖、270克用以上方法製成的蛋黃粉、290克脫脂奶粉、4.4克氯化鈣、1.85克氯化鉀、0.01克硫氨素、0.1克抗壞血酸鈉、0.6克乙酸維生素和0.04克煙酸胺混合後,每份取25克放入防水鋁箔袋內,熱封好,即製得該固態製品。因袋內空氣含水量少,該產品勿須冷藏,在室溫狀態下就可長期穩定存放。其具有良好的水溶性及分散性,使用前只需將1小袋該固態品溶於約150-300ml水製成流質食品,吸入體內或灌入鼻腔、胃或腸內即可。
2)、製備固體醫藥品
為了做BALL-1細胞的皮下移植手術,在剛產下的田鼠體內注入用傳統方法製取的免疫血清,以減少其免疫反應,按一般方法餵養3周後,取出田鼠皮下形成的腫瘤,將其切成小片,然後把小片分散溶在生理鹽水中。溶出的腫瘤細胞用無血清的RPMI1640培養基(pH值7.2)清洗後,再將其溶在新配製的同一種培養基中,稀釋培養液濃度至每毫升含2×106個細胞,並在35℃下保存。
在細胞懸液中加入200IU/ml人體a-干擾素,培養約2小時後,加入300HA/ml HVJ,再培養20小時,誘導培養體產生更多的人體a-干擾素。將細胞培養液在4℃、1,000×g條件下離心,去除沉澱物,上清液用膜過濾,把濾液加進一裝有防a-干擾素抗體的層析柱中,再加入緩衝液使未被吸收的組分流出,隨後把被柱子吸收的組分洗脫出來並濃縮成濃度約為0.01w/v%的人體a-干擾素溶液,其中的人體a-干擾素的比活力約為2×108Iu/mg蛋白,每隻田鼠可製得約4ml a-干擾素。
將6克無水海藻糖裝進100ml的防潮塑料瓶中,再往瓶中注入0.2ml約含4×106IU的人體a-干擾素溶液,用橡膠塞給瓶子無菌封蓋,這樣就可製得固體醫藥品。根據其製備過程,含人體a-干擾素的溶液經和無水海藻糖接觸,就很容易脫水乾燥,其不需冷凍乾燥,就能使固體製品的a-干擾素穩定高效。
該產品易溶於水,其中的人體a-干擾素可作為一種抗敏性試劑(如:抗病毒試劑、抗腫瘤試劑和抗風濕症試劑等),經滴注或肌注進入人體內,有效地預防或治療多種疾病。該產品適用於內科,還可作口腔試劑及診斷劑。
3)、製備固體醫藥品
將源於人體淋巴素的BALL-1細胞接種到加入20%的胎牛血清的Eagle基礎培養基(PH值7.4)中,按照常規方法在37℃的懸浮體中培養,培養出的細胞用無血清的Eagle基礎培養基(PH值7.4)清洗後,將其倒入新配製的含20%胎牛血清的Eagle基礎培養基中,並濃縮至濃度為1×107cells/ml。在溶液中加入1, 000HA/ml HVJ,在38℃下恆溫培養24小時,使HVJ誘變成a-hTNF。將製得含a-hTNF的細胞懸液在4℃,1,000×g下離心,上清液在含0.01M磷酸鹽緩衝液的生理鹽水中透析15小時後,用膜過濾。為純化a-hTNF溶液,將濾液加入一個裝有抗干擾素抗體的柱子中,把未被柱子吸收的組分倒進一裝有抗腫瘤壞死a-基因單株抗體、具有親和性的層析柱中,洗脫出被層析柱吸收的組分,得到a-hTNF溶液濃度至0.01w/v%,其中a-hTNF的比活力大約為2×106JRU/mg蛋白。這樣a-hTNF的得率約為5×104JRU/L細胞培養液。
將10克無水海藻糖裝入100ml的瓶中,再注入0.5ml含1×105JRU a-hTNF的溶液,用橡膠塞無菌封蓋後,即可製得該產品。用以上方法製得的藥品,粉末狀無水海藻糖吸水使a-hTNF的溶液脫水乾燥,不需經冷凍乾燥處理,就能使a-hTNF穩定高效。
該產品易溶於水,a-hTNF可作為一種抗敏性試劑(如:抗病毒試劑、抗腹腫劑及抗免疫疾病劑等),經滴注或肌注進入人體內有效地預防或治療多種疾病。該產品適用於內科,也可作口腔試劑及診斷劑。
3.海藻糖在化妝品中的應用:
海藻糖在化妝品上的應用是基於其具有優異的保持細胞活力和生物大分子活性的特性。皮膚細胞,尤其是表皮細胞在高溫、高寒、乾燥、強紫外線輻射等環境下,極易失去水分發生角質化,甚至死亡脫落使皮膚受損。海藻糖在這種情況下能夠在細胞表層形成一層特殊的保護膜,從膜上析出的粘液不僅滋潤著皮膚細胞,還具有將外來的熱量輻射出去的功能。從而保護皮膚不致受損。隨著人們對海藻糖功能和作用的認識,海藻糖作為新一代的超級保濕因子將成為化妝品市場消費的一個熱點。目前,國內外已有不少廠家成功將海藻糖添加到化妝品中。海藻糖在化妝品中使用參考如下:
2克聚氧乙烯乙二醇單硬酯酸脂,5克自乳化甘油醯硬酯酸脂,1克a-葡糖芸香苷,1克液體凡士林,10克甘油三(2-乙基己酸)酯,將這些物質與2克藻糖粉末混合,按一般方法加熱溶解,得到的溶液加進2克L-乳酸,5克,3-丁二醇及66克純淨水。此反應溶液經高速攪拌器乳化,再在高溫條件下加進足量的調和劑,即得到化妝霜。
超級防晒保濕因子—海藻糖
海藻糖是一種天然的糖類,存在於許多沙漠植物中,在植物乾枯時形成一層玻璃狀的基質,保護其內部結構,直至雨水來到,植物可奇蹟般地起「死」而復生。
大量的研究與實踐表明,海藻糖能有效地保護表皮細胞膜結構,活化細胞,調理肌膚,令肌膚健康自然、有彈性。表皮細胞在高溫、高寒、乾燥、強紫外線輻射等環境下,極易失去水分而使皮膚受損,海藻糖在這種情況下能夠在細胞表層形成一層特殊的保護膜,保持皮膚原有營養和水分,避免皮膚晒傷及黑色素沉澱,有效抵抗皮膚老化現象;從膜上析出的粘液可溫和滋潤肌膚,使肌膚瑩亮、光澤、柔嫩。
目前國內外一些比較著名的化妝品企業,如范思哲系列化妝品、雪白系列化妝品、草木年華海藻糖活泉補水系列化妝品等都已將產品中的海藻糖作為產品宣傳的重點內容。
海藻糖是藥品還是糖類?
海藻糖是由兩個葡萄糖分子以a,a,1,1-糖苷鍵構成非還原性糖,自身性質非常穩定,海藻糖對生物體具有神奇的保護作用,是因為海藻糖在高溫、高寒、高滲透壓及乾燥失水等惡劣環境條件下在細胞表面能形成獨特的保護膜,有效地保護蛋白質分子不變性失活,從而維持生命體的生命過程和生物特徵。許多對外界惡劣環境,表現出非凡抗逆耐受力的物種,都與它們體內存在大量的海藻糖有直接的關係。和自然界中如蔗糖、葡萄糖等其它糖類,均不具備這一功能。這一獨特的功能特性,使得海藻糖除了可以作為蛋白質藥物、酶、疫苗和其他生物製品的優良活性保護劑以外,還是保持細胞活性、保濕類化妝品的重要成分,更可作為防止食品劣化、保持食品新鮮風味、提升食品品質的獨特食品配料,大大拓展了海藻糖作為天然食用甜味糖的功能。
海藻糖對生物酶製劑中反應中激活劑與穩定劑
溫度是影響酶反應效率的重點因素之一,高溫能提高酶的催化活力,但易使酶失活。耐熱酶的發現為分子生物學帶來巨大的進步,如PCR和連接酶鏈式反應的產生,目前局限於從一些耐熱菌中分離得到耐熱酶,而且酶催化反應類型也受到限制。研究發現海藻糖在高溫下能保持酶的正常活性,甚至起熱激活作用,還能用於提高幹燥保存的酶的活性。在反應體系中加入海藻糖,使熱敏感的酶在高溫下穩定性和活性增加,可當作耐熱酶使用,海藻糖的這一作用在生物藥學和工業生產領域具有廣泛的應用價值。 未加海藻糖的限制性內切酶Nocl在溫度由45℃升到50℃時失活,加了海藻糖時酶不但不失活而且活力繼續升高,說明海藻糖能抑制高溫下酶的失活;37℃時海藻糖能夠激活DNasel,加了海藻糖,溫度升到50℃時酶活力仍顯著升高;豬的胰脂肪酶在無水海藻糖介質中可以耐受100℃高溫,有水時則會失活。有實驗表明海藻糖通過影響蛋白水合作用來穩定和激活蛋白,它可以降低溶液中蛋白質的水化作用,乾燥時則能取代水或作為玻璃樣穩定劑。海藻糖能阻止酶發生不可逆的熱凝聚-熱變性,與分子伴侶的功能相類似,實驗中將一些分子伴侶與海藻糖共同使用,能進一步擴大對酶具有熱穩定和熱激活作用的溫度範圍。另外海藻糖並不是對檢測的所有酶都有熱穩定和熱激活的作用,說明只有一些蛋白可能具有海藻糖識別和作用的位點。 獲得全長cDNA文庫,有利於分子克隆和全長cDNA測序,反轉錄反應是構建cDNA文庫的重要反應,mRNA的二級結構能夠終止反轉錄反應,釋放mRNA/非互補cDNA雜合體,導致合成全長cDNA效率很低,這是構建高質量的cDNA文庫最主要的問題。以前解決這一問題主要是在反應前使樣品變性,如熱變性、加氫氧化甲基汞處理mRNA等或者反應中提高反應溫度。前一類方法對破壞mRNA二級結構效果不佳,特別是從長轉錄產物獲得全長的cDNA,而後者雖然對破壞mRNA二級結構比較有用,但除了TchDNA聚合酶外,其它反轉錄酶者不耐熱,而TchDNA聚合酶催化反應需Mn2+,這容易造成mRNA在反應前就降解了。實驗證明海藻糖能使鼠白血病病毒逆轉錄酶具有熱穩定和熱激活特性,酶在60℃仍具有全部活性,足以在mRNA二級結構誘導終止反應之前合成全長的cDNA,反應效率大大提高。另外推測海藻糖可能具有改變核酸構型的作用,例如減少反轉錄反應中mRNA的二級結構。 生產中利用海藻糖熱穩定和熱激活的雙重功能,可以減少酶的用量和提高反應速率,提高消耗/產出和時間/產出比值,在一系列酶反應中都有很大潛力,如生化反應、診斷或工業生產領域,更重要的是熱激活能用於提高反應程度和總效率,獲得標準反應條件下不可能的產量。另外,利用熱穩定和熱激活的作用,可開發以前在常規反應條件下不可能進行的反應,例如專一性要求特別高的核酸雜交實驗,反應體系加入海藻糖,就可在適宜的溫度下同時使用幾種限制/修飾酶,提高雜交反應特異性,減少假陽性結果。
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保存:冷凍-18度
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微生物具有容易變異的特性,因此,在保藏過程中,必須使微生物的代謝處於最不活躍或
相對靜止的狀態,才能在一定的時間內使其不發生變異而又保持生活能力。
低溫、乾燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素,所以,菌種保藏方法雖
多,但都是根據這三個因素而設計的。
保藏方法大致可分為以下幾種:
1.傳代培養保藏法
又有斜面培養、穿刺培養、皰肉培養基培養等(後者作保藏厭氧細菌用),培養後於
4—6℃冰箱內保存。
2.液體石蠟覆蓋保藏法
是傳代培養的變相方法,能夠適當延長保藏時間,它是在斜面培養物和穿刺培養物上
面覆蓋滅菌的液體石蠟,一方面可防止因培養基水分蒸發而引起菌種死亡,另一方面可阻
止氧氣進入,以減弱代謝作用。
3.載體保藏法
是將微生物吸附在適當的載體,如土壤、沙子、硅膠、濾紙上,而後進行乾燥的保藏
法,例如沙土保藏法和濾紙保藏法應用相當廣泛。
4.寄主保藏法
用於目前尚不能在人工培養基上生長的微生物,如病毒、立克次氏體、螺旋體等,它
們必須在生活的動物、昆蟲、雞胚內感染並傳代,此法相當於一般微生物的傳代培養保藏
法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍乾燥保藏法進行保藏。
5.冷凍保藏法
可分低溫冰箱(-20—-30℃,-50—-80℃)、乾冰酒精快速凍結(約-70℃)和液氮
(-196℃)等保藏法。
6.冷凍乾燥保藏法
先使微生物在極低溫度(-70℃左右)下快速冷凍,然後在減壓下利用昇華現象除去
水分(真空乾燥)。
有些方法如濾紙保藏法、液氮保藏法和冷凍乾燥保藏法等均需使用保護劑來製備細胞
懸液,以防止因冷凍或水分不斷昇華對細胞的損害。保護性溶質可通過氫和離子鍵對水和
細胞所產生的親和力來穩定細胞成分的構型。保護劑有牛乳、血清、糖類、甘油、二甲亞
?等。
三、器材
細菌、酵母菌,放線菌和黴菌;
肉膏蛋白?斜面培養基,滅菌脫脂牛乳,滅菌水,化學純的液體石蠟,甘油,五氧化
二磷,河沙,瘦黃土或紅土,冰塊、食鹽,乾冰,95%酒精,10%鹽酸,無水氯化鈣;
滅菌吸管,滅菌滴管,滅菌培養皿,管形安瓿管,淚滴形安瓿管(長頸球形底),40
目與 100目篩子,油紙,濾紙條(0.5×1.2cm),乾燥器,真空泵,真空壓力錶,噴燈
,L形五通管,冰箱,低溫冰箱(-30℃),液氮冷凍保藏器。
四、操作步驟、各保藏法的應用範圍及優缺點
下列各法可根據實驗室具體條件與需要選做。
1.斜面低溫保藏法
將菌種接種在適宜的固體斜面培養基上,待菌充分生長後,棉塞部分用油紙包紮好,
移至2—8℃的冰箱中保藏。
保藏時間依微生物的種類而有不同,黴菌、放線菌及有芽孢的細菌保存2—4個月,移
種一次。酵母菌兩個月,細菌最好每月移種一次。
此法為實驗室和工廠菌種室常用的保藏法,優點是操作簡單,使用方便,不需特殊設
備,能隨時檢查所保藏的菌株是否死亡、變異與污染雜菌等。缺點是容易變異,因為培養
基的物理、化學特性不是嚴格恒定的,屢次傳代會使微生物的代謝改變,而影響微生物的
性狀;污染雜菌的機會亦較多。
2.液體石蠟保藏法
(1)將液體石蠟分裝於三角燒瓶內,塞上棉塞,並用牛皮紙包紮,1.05kg/cm2>,
121.3℃滅菌30分鐘,然後放在40℃溫箱中,使水汽蒸發掉,備用。
(2)將需要保藏的菌種,在最適宜的斜面培養基中培養,使得到健壯的菌體或孢子
。
(3)用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟,注入已長好菌的斜面上,其用量以高出斜面
頂端1cm為準(圖Ⅶ-12),使菌種與空氣隔絕。
(4)將試管直立,置低溫或室溫下保存(有的微生物在室溫下比冰箱中保存的時間
還要長)。
此法實用而效果好。黴菌、放線菌、芽孢細菌可保藏2年以上不死,酵母菌可保藏1—
2年,一般無芽孢細菌也可保藏1年左右,甚至用一般方法很難保藏的腦膜炎球菌,在37℃
溫箱內,亦可保藏3個月之久。此法的優點是製作簡單,不需特殊設備,且不需經常移種
。缺點是保存時必須直立放置,所佔位置較大,同時也不便攜帶。從液體石蠟下面取培養
物移種後,接種環在火焰上燒灼時,培養物容易與殘留的液體石蠟一起飛濺,應特別注意
。
3.濾紙保藏法
(1)將濾紙剪成0.5×1.2cm的小條,裝入0.6×8cm的安瓿管中,每管1—2張,塞
以棉塞,1.05kg/cm2>,121.3℃滅菌30分鐘。
(2)將需要保存的菌種,在適宜的斜面培養基上培養,使充分生長。
(3)取滅菌脫脂牛乳1—2ml滴加在滅菌培養皿或試管內,取數環菌苔在牛乳內混勻
,製成濃懸液。
(4)用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液內,使其吸飽,再放回至安瓿管中,
塞上棉塞。
(5)將安瓿管放入內有五氧化二磷作吸水劑的乾燥器中,用真空泵抽氣至幹。
(6)將棉花塞入管內,用火焰按圖Ⅶ-13熔封,保存於低溫下。
(7)需要使用菌種,復活培養時,可將安瓿管口在火焰上燒熱,滴一滴冷水在燒熱
的部位,使玻璃破裂,再用鑷子敲掉口端的玻璃,待安瓿管開啟後,取出濾紙,放入液體
培養基內,置溫箱中培養。
細菌、酵母菌、絲狀真菌均可用此法保藏,前兩者可保藏2年左右,有些絲狀真菌甚
至可保藏14—17年之久。此法較液氮、冷凍乾燥法簡便,不需要特殊設備。
4.沙土保藏法
(1)取河沙加入10%稀鹽酸,加熱煮沸30分鐘,以去除其中的有機質。
(2)倒去酸水,用自來水沖洗至中性。
(3)烘乾,用40目篩子過篩,以去掉粗顆粒,備用。
(4)另取非耕作層的不含腐植質的瘦黃土或紅土,加自來水浸泡洗滌數次,直至中
性。
(5)烘乾,碾碎,通過100目篩子過篩,以去除粗顆粒。
(6)按一份黃土、三份沙的比例(或根據需要而用其他比例,甚至可全部用沙或全
部用土)摻合均勻,裝入10×100mm的小試管或安瓿管中,每管裝1g左右,塞上棉塞,進
行滅菌,烘乾。
(7)抽樣進行無菌檢查,每10支沙土管抽一支,將沙土倒入肉湯培養基中,37℃培
養48小時,若仍有雜菌,則需全部重新滅菌,再作無菌試驗,直至證明無菌,方可備用。
(8)選擇培養成熟的(一般指孢子層生長豐滿的,營養細胞用此法效果不好)優良
菌種,以無菌水洗下,製成孢子懸液。
(9)於每支沙土管中加入約0.5ml(一般以剛剛使沙土潤濕為宜)孢子懸液,以接
種針拌勻。
(10)放入真空乾燥器內,用真空泵抽幹水分,抽幹時間越短越好,務使在12小時內
抽幹。
(11)每10支抽取一支,用接種環取出少數沙粒,接種於斜面培養基上,進行培養,
觀察生長情況和有無雜菌生長,如出現雜菌或菌落數很少或根本不長,則說明製作的沙土
管有問題,尚須進一步抽樣檢查。
(12)若經檢查沒有問題,用火焰熔封管口,放冰箱或室內乾燥處保存。每半年檢查
一次活力和雜菌情況。
(13)需要使用菌種,復活培養時,取沙土少許移入液體培養基內,置溫箱中培養。
此法多用於能產生孢子的微生物如黴菌、放線菌,因此在抗生素工業生產中應用最廣
,效果亦好,可保存2年左右,但應用於營養細胞效果不佳。
5.液氮冷凍保藏法
(1)準備安瓿管用於液氮保藏的安瓿管,要求能耐受溫度突然變化而不致破裂,因
此,需要採用硼硅酸鹽玻璃製造的安瓿管,安瓿管的大小通常使用75×10mm的,或能容1
.2mm液體的。
(2)加保護劑與滅菌保存細菌、酵母菌或黴菌孢子等容易分散的細胞時,則將空安
瓿管塞上棉塞,1.05kg/cm2,121.3℃滅菌15分鐘:若作保存黴菌菌絲體用則需在安瓿
管內預先加入保護劑如10%的甘油蒸餾水溶液或10%二甲亞?蒸餾水溶液,加入量以能浸
沒以後加入的菌落圓塊為限,而後再用1.05kg/cm2>,121.3℃滅菌15分鐘。
(3)接入菌種將菌種用10%的甘油蒸餾水溶液製成菌懸液,裝入已滅菌的安瓿管;
黴菌菌絲體則可用滅菌打孔器,從平板內切取菌落圓塊,放入含有保護劑的安瓿管內,然
後用火焰熔封。浸入水中檢查有無漏洞。
(4)凍結再將已封口的安瓿管以每分鐘下降1℃的慢速凍結至-30℃。若細胞急劇冷
凍,則在細胞內會形成冰的結晶,因而降低存活率。
(5)保藏經凍結至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器(圖Ⅶ-14)的小圓筒內
,然後再將小圓筒放入液氮保藏器內。液氮保藏器內的氣相為-150℃,液態氮內為-196℃
。
(6)恢復培養保藏的菌種需要用時,將安瓿管取出,立即放入38—40℃的水浴中進
行急劇解凍,直到全部融化為止。再打開安瓿管,將內容物移入適宜的培養基上培養。
此法除適宜於一般微生物的保藏外,對一些用冷凍乾燥法都難以保存的微生物如支原
體、衣原體、氫細菌、難以形成孢子的黴菌、噬菌體及動物細胞均可長期保藏,而且性狀
不變異。缺點是需要特殊設備。
6.冷凍乾燥保藏法
(1)準備安瓿管用於冷凍乾燥菌種保藏的安瓿管宜採用中性玻璃製造,形狀可用長
頸球形底的,亦稱淚滴型安瓿管(圖Ⅶ-15),大小要求外徑6—7.5mm,長105mm,球部
直徑9—11mm,壁厚0.6—1.2mm。也可用沒有球部的管狀安瓿管。塞好棉塞,1.
05kg/cm2>,121.3℃滅菌30分鐘,備用。
(2)準備菌種,用冷凍乾燥法保藏的菌種,其保藏期可達數年至十數年,為了在許
多年後不出差錯,故所用菌種要特別注意其純度,即不能有雜菌污染,然後在最適培養基
中用最適溫度培養,使培養出良好的培養物。細菌和酵母的菌齡要求超過對數生長期,若
用對數生長期的菌種進行保藏,其存活率反而降低。一般,細菌要求24—48小時的培養物
;酵母需培養3天;形成孢子的微生物則宜保存孢子;放線菌與絲狀真菌則培養7—10天。
(3)製備菌懸液與分裝以細菌斜面為例,用脫脂牛乳2ml左右加入斜面試管中,製成
濃菌液,每支安瓿管分裝0.2ml。
(4)冷凍冷凍乾燥器有成套的裝置出售,價值昂貴,此處介紹的是簡易方法與裝置
,可達到同樣的目的。
將分裝好的安瓿管放低溫冰箱中冷凍,無低溫冰箱可用冷凍劑如乾冰(固體CO2>)酒
精液或乾冰丙酮液,溫度可達-70℃。將安瓿管插入冷凍劑,只需冷凍4—5分鐘,即可使
懸液結冰。
(5)真空乾燥為在真空乾燥時使樣品保持凍結狀態,需準備冷凍槽,槽內放碎冰塊
與食鹽,混合均勻,可冷至-15℃。裝置儀器如圖Ⅶ-16,安瓿管放入冷凍槽中的乾燥瓶內
。
抽氣一般若在30分鐘內能達到93.3Pa(0.7mmHg)真空度時,則乾燥物不致熔化,
以後再繼續抽氣,幾小時內,肉眼可觀察到被乾燥物已趨乾燥,一般抽到真空度26.7Pa
(0.2mmHg),保持壓力6—8小時即可。
(6)封口抽真空乾燥後,取出安瓿管,接在封口用的玻璃管上,可用L形五通管(圖
Ⅶ-17)繼續抽氣,約10分鐘即可達到26.7Pa(0.2mmHg)。於真空狀態下,以煤氣噴燈
的細火焰在安瓿管頸中央進行封口。封口以後,保存於冰箱或室溫暗處。
此法為菌種保藏方法中最有效的方法之一,對一般生活力?的微生物及其孢子以及無
芽胞菌都適用,即使對一些很難保存的致病菌,如腦膜炎球菌與淋病球菌等亦能保存。適
用於菌種長期保存,一般可保存數年至十餘年,但設備和操作都比較複雜。
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孤獨是卓越心靈的命運
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